Ingeniería de anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones en el tratamiento de la esclerosis múltiple

*Profesor de Investigación de la Agencia Estatal. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” y académico de Número de la Real Academia Nacional de Farmacia La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad neurológica autoinmune caracterizada por la aparición de placas de desmielinización, discapacidad, alteraciones sensoriales y motoras, y, eventualmente, neurodegeneración. Progresa normalmente en tres fases: un estado preclínico, detectable tan sólo mediante imagen por resonancia magnética; una fase “recurrente-remitente” caracterizada por episodios de disfunción neurológica con resolución subsiguiente (“brotes”); y una fase progresiva, que normalmente ocurre después de las fases de remisión. Hasta muy recientemente no existía tratamiento adecuado para esta enfermedad. En las últimas décadas se ha producido un avance espectacular en las inmunoterapias contra la Esclerosis Múltiple, basadas principalmente en los progresos obtenidos en el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad y en la utilización terapéutica de anticuerpos monoclonales (Mabs) de nueva generación. Estos avances han conseguido, recientemente, disminuir la aparición e intensidad de los “brotes”, retrasar o detener su progresión y, en algunas ocasiones, favorecer remielinización de las lesiones. Brevemente, los Mabs accesibles en la actualidad disminuyen citotóxicamente la población de linfocitos B CD20 (Ocrezilumab, Rituximab, Ofatumumab y Ublitoximab), de células T auxiliares CD52, inhiben su migración a través de la barrera hematoencefálica (Natazilumab), o favorecen la remielinización (Opicinumab). Los Mabs utilizados inicialmente eran de origen murino, con elevada inmunogenicidad, y limitada eficacia en seres humanos. Sin embargo, más recientemente, los nuevos abordajes de biología molecular conocidos como “Ingeniería de Proteínas” han conseguido manipular el ADN de los anticuerpos clásicos produciendo, mediante técnicas “Evolución Dirigida”, cantidades industriales de nuevos Mabs “quiméricos” o “humanizados”, disminuyendo considerablemente su inmunogenicidad inicial, y aumentando su eficacia. Este artículo describe, en un entorno divulgativo, dirigido principalmente a los profesionales farmacéuticos, los conceptos básicos de ingeniería de proteínas, la estructura de anticuerpos y las modificaciones que han permitido estos importantes avances, así como una introducción a los mecanismos fisiopatológicos de la Esclerosis Múltiple y los Mabs más comúnmente utilizados actualmente en su tratamiento. Ingeniería de proteínas La ingeniería de proteínas involucra el diseño y producción de nuevas proteínas con funciones mejoradas respecto a la ya existentes en la naturaleza. Se basa en la utilización de tecnologías de DNA recombinante para cambiar selectivamente su secuencia primaria, en uno o más aminoácidos, modificando así entre otras propiedades, la estructura y capacidad catalítica de los centros activos en los enzimas, o las propiedades de especificidad e inmunogenicidad en los anticuerpos. Entre los métodos más eficaces en ingeniería de proteínas destaca la “Evolución Dirigida”, galardonada con el Premio Nobel de Química 2018, concedido a Frances H. Arnold, George P. Smith y Gregory P. Winter. Este método reproduce aceleradamente en el laboratorio, el lento proceso de “selección natural” que ocurre en la naturaleza. Brevemente, la “Evolución Dirigida” combina rápida y secuencialmente, los procedimientos de mutagénesis dirigida en el ADN que codifica la proteína, con la selección de las proteínas mutadas más eficaces, mediante técnicas de cribado de alto rendimiento. Se trata de un proceso cíclico, con varias iteraciones, donde cada ciclo de evolución debe mejorar los resultados del anterior. Arnold consiguió así producir, por primera vez, un enzima “evolucionado” de la subtilisina E, que resultaba activo en altas concentraciones de solventes orgánicos como la dimetilformamida, algo previamente inexistente en la naturaleza. George P. Smith consiguió poco después, manipulando el genoma de un fago filamentoso, expresar el gen de un pequeño péptido exógeno sobre su cápsida natural. Se hizo posible entonces expresar una o más copias de cualquier proteína exógena sobre la cápsida del fago, creando así el transcendental método de la “pantalla de fagos”. Finalmente, Gregory P. Winter extendió el método de la pantalla de fagos a los anticuerpos monoclonales (Mabs), consiguiendo producir en el laboratorio Mabs quiméricos y humanizados conteniendo sobre la misma estructura molecular, los dominios constantes de los anticuerpos humanos y los dominios variables de los anticuerpos murinos. Este procedimiento permitió sustituir definitivamente la tecnología de hibridomas, utilizada previamente en la fabricación de Mabs, por un procedimiento que no empleaba células animales, era capaz de generar cantidades industriales de Mabs, disminuía considerablemente la inmunogenicidad de las preparaciones, y aumentaba espectacularmente su especificidad. Actualmente, este procedimiento ha permitido desarrollar y producir más de 300 Mabs, con una repercusión comercial que supera ya la mitad de las ventas en el mercado biofarmacéutico mundial, valorado aproximadamente en 237.251 millones de dólares en 2018. Anticuerpos monoclonales y su producción La inmunización de un animal con un antígeno conteniendo varios epítopos produce en su suero una mezcla “policlonal” de anticuerpos, cada uno de ellos activo contra uno solo de los epítopos presentes en el antígeno. Este era el método primitivo de producción de anticuerpos y vacunas, empleando colonias de animales vacunos o roedores, inmunizados para la producción de reducidas cantidades de anticuerpo. Resultó crucial entonces incrementar la escala de la producción y separar las diferentes especificidades, de manera que cada población de anticuerpos producidos fuese activa, específicamente, contra uno sólo de los determinantes antigénicos o epítopos. Esta población homogénea de anticuerpos contra un solo epítopo, se conoció como “anticuerpo monoclonal”. Describiremos brevemente, a continuación, la estructura de los anticuerpos, para detallar después las modificaciones estructurales que han conducido a los anticuerpos comerciales actuales. Brevemente, los anticuerpos son macromoléculas plasmáticas, inmunoglobulinas, en forma de Y (Figura 1). Gerald Edelman describió que la Y estaba compuesta por dos cadenas pesadas “H” (del inglés “Heavy”) y dos cadenas ligeras “L” (del inglés “Light”), unidas por puentes disulfuro sensibles a la digestión por papaína, organizadas en dos fracciones, la fracción constante Fc (constant fraction), que se une al receptor, y la fracción variable Fab (antigen binding fraction), que se une a los antígenos. Los sitios de unión a antígenos Fab contienen así mismo porciones constantes (C) y variables (V) de las cadenas pesadas (CH y VH) y ligeras (CL y VL) respectivamente. Juntas componen el CDR (Complementary Determining Region) que determina la variabilidad y la especificidad del anticuerpo, frente a sus potenciales antígenos. La base de la Y permite modular la respuesta inmune, fijándose a receptores celulares de superficie de los linfocitos B (Fc), que posteriormente liberan citoquinas y atraen a nuevos linfocitos que “opsonizan” (recubren) la toxina infectante. Este fragmento base de la Y recibe el nombre de fracción cristalizable y está compuesto de dos o tres cadenas pesadas proteicas glicosiladas, donde los oligosacáridos confieren especificidad adicional para su unión al receptor Fc en la superficie de los linfocitos B, u a otras proteínas inmunitarias como el Complemento. Adicionalmente, la respuesta inmune puede recibir la ayuda de linfocitos T (originados en el Timo), conocidos como células auxiliares T (T helper cells) o linfocitos T CD4+ que contribuyen a destruir citotóxicamente la bacteria o virus invasor. El primer método de producción de anticuerpos monoclonales libre de animales portadores fue la tecnología de hibridomas, propuesta por Jerne, Kholer y Milstein en los años 70 del pasado siglo, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiologia y Medicina en 1984. Los hibridomas son células de fusión entre un linfocito B de un ratón inmunizado y una célula de mieloma (tumor de células B). En este hibridoma, la capacidad de producción de anticuerpos se deriva del linfocito B original, mientras que su inmortalización y capacidad de proliferación, se derivan de la célula de mieloma. El hibridoma multiplica enormemente, por su longevidad y capacidad de reproducción, la producción inicial de anticuerpos sobre plataformas animales. Los anticuerpos producidos son “monoclonales”, porque resultan químicamente idénticos y selectivos solamente contra cada uno de los epítopos del antígeno. Sin embargo, la tecnología de hibridomas, revolucionaria en su momento, presenta importantes desventajas que la desaconsejan en la actualidad. Entre otras, los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas suelen presentar menor afinidad por el epítopo que los policlonales originales. En segundo lugar, el origen murino de los hibridomas y sus monoclonales presentaba diferencias importantes con los anticuerpos humanos, por lo que su administración desencadenaba con frecuencia reacciones inmunitarias no deseadas en los pacientes, inutilizando el anticuerpo monoclonal administrado. En este contexto, la generación in vitro de anticuerpos monoclonales de alta especificidad mediante ingeniería genética y de proteínas, propuesta por Sir Gregory P. Winter, evita los inconvenientes asociados a la tecnología de hibridomas, haciendo innecesaria la inmunización de animales y facilitando la producción de cantidades industriales de anticuerpos monoclonales “humanizados” de diseño. Brevemente, Winter extendió la metodología de “Pantalla de Fagos” (Figura 2) propuesta por Smith, para expresar en la cápsida del fago, tan sólo las regiones variables Fab de los anticuerpos responsables su unión al antígeno. Winter extendió la metodología de “Pantalla de Fagos” propuesta por Smith, para expresar en la cápsida del fago, tan sólo las regiones variables Fab de los anticuerpos responsables su unión al antígeno. Brevemente, insertó sobre el gen III de la cápsida del fago los genes responsables de la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas del fragmento Fab, consiguiendo expresar sobre la cápsida, una Región Complementaria Definida (CDR) completa, y mejorando iterativamente su selectividad para determinados antígenos. Después de obtener una enorme librería de los fragmentos Fab de anticuerpos aisló los más específicos utilizando su afinidad por el antígeno de interés utilizando un cribado masivo. Brevemente, sometió a evolución dirigida los genes Fab optimizados, volviendo a mutarlos y expresarlos sobre la cápsida de virus, seleccionando iterativamente los nuevos fragmentos Fab más específicos. Después de tres ciclos de evolución dirigida consiguió enriquecer un millón de veces la especificidad el anticuerpo parental. Este logro representó el comienzo de una gran revolución en la industria farmacéutica, que comprendió inmediatamente cómo podría producir cantidades industriales de anticuerpos monoclonales humanos sin necesidad de inmunizar animales, ni construir biorreactores de hibridomas. La Figura 3 resume las principales manipulaciones seguidas para transformar un anticuerpo de origen murino en uno completamente humano contra el mismo antígeno, con referencia a los principales anticuerpos monoclonales comercializados contra la EM. Los anticuerpos quiméricos (nombres terminados en –ximab) sustituyen la región Fc de los anticuerpos murinos por regiones Fc de anticuerpos humanos, alcanzando un 65% de humanización. Los anticuerpos humanizados (nombres terminados en –zumab) contienen regiones Fc y parte de la región Fab de los anticuerpos humanos, manteniendo su carácter murino, tan solo en la región de unión al antígeno, y alcanzando el 90% de humanización. Finalmente, la utilización de ratones transgénicos expresando las regiones Fab humanas han permitido la producción de Mabs completamente humanizados (nombres terminados en –umab). Esclerosis Múltiple La EM es una enfermedad neurológica caracterizada por la presencia de lesiones desmielinizantes, neuroinflamación y daño axonal en el sistema nervioso central. La EM es la enfermedad neurológica más frecuente en adultos jóvenes con prevalencia de casi el doble en mujeres que en varones. Es la causa más frecuente de parálisis en los países desarrollados, siendo casi inexistente en los africanos negros y en las poblaciones indígenas de América y Oceanía. Aunque sus causas no se conocen con precisión, la mayor parte de los autores coinciden en que parece derivarse de un ataque autoinmune de los linfocitos, células T auxiliares y macrófagos del paciente, sobre las vainas de mielina que recubren los axones, disminuyendo progresivamente la velocidad de la transmisión sináptica. Sus síntomas suelen incluir, entre otros, mareos, fatiga, lentitud de reacción, alteraciones sensoriales o motoras, entumecimiento y hormigueos (parestesias), incontinencia, pérdida progresiva de fuerza muscular, dificultades de movilidad y eventualmente, neurodegeneración. El neurólogo francés Jean-Martin Charcot la describió, ya en siglo XIX, como “Sclérose en plaques diseminés”, una entidad clínica bien diferenciada, con lesiones desmielinizantes en cerebro y médula espinal. Su etiología puede involucrar diversos factores incluyendo (entre otros), infecciones virales (notablemente el virus de Epstein-Barr), tabaquismo y deficiencias en vitamina D, toxinas ambientales o dietéticas y alteraciones características en la microbiota intestinal. Suelen distinguirse diversos tipos de EM; el Síndrome Clínico Aislado, con único evento inicial con síntomas neurológicos de transtorno desmielinizante; la EM Recurrente-Remitente (EMRR) con episodios periódicos de disfunción neurológica seguidos de recuperación (conocidos como “brotes”); la EM Secundaria Progresiva (EMSP) caracterizada por un empeoramiento progresivo de los síntomas después de 10-20 años de EMRR; la EM Primaria Progresiva (EMPP), sin “brotes” pero con una progresión gradual de la sintomatología y la EM Progresiva-Recurrente (EMPR), que progresa continuamente desde el inicio de la enfermedad con crisis severas periódicas. Los diversos tipos de EM parecen evolucionar por mecanismos fisiopatológicos diferenciados. Mecanismos patogénicos de la Esclerosis Múltiple Los mecanismos que subyacen al desarrollo de la EM no se conocen con precisión. Sin embargo, existen ciertas evidencias que permiten intuir ahora algunos aspectos generales del ataque autoinmune desmielinizante. El hecho de que las lesiones EM acumulen proporciones muy elevadas de linfocitos B y células auxiliares T CD4+, leucocitos y macrófagos sugiere que estas células sanguíneas, y su migración a través de la barrera hematoencefálica (BHE), juega un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad. Particularmente relevante es el gen HLA (Human Leucocyte Antigen), un gen que codifica la producción del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MSC-Major Histocompatibility Complex), la proteína de superficie que permite a los leucocitos distinguir si otra célula, endógena o infectante, pertenece o no al mismo organismo. Los linfocitos B expresan, sobre su proteína HLA, una proteína denominada RASGPR2. Si este antígeno es reconocido por el receptor de células T (TCR), la interacción conduce a la proliferación de ambas células B y T, en un fenómeno que se conoce como autoproliferación. Estas células B y T atraviesan, por un mecanismo desconocido, la barrera hematoencefálica, originando RASGPR2 intracerebral. Si las neuronas u otras células cerebrales expresan RASGPR2, las células T que infiltran el cerebro se activan y disparan un ataque autoinmune con liberación de mediadores inflamatorios, incluyendo, entre otras citokinas, el interferón-γ. La secreción de citokinas conduce a la activación de células inmunes del cerebro como microglia, astrocitos y macrófagos que degradan las vainas de mielina. Resulta conveniente resaltar aquí, que las proteínas de la mielina (como la proteína básica de mielina y el proteolípido de mielina) presentan además, algunas similaridades importantes con las proteínas de muchos virus y bacterias, por lo que podrían disparar, por sí mismas, el ataque autoinmune de un sistema inmunitario deficiente. Anticuerpos monoclonales en el tratamiento de la Esclerosis Múltiple Los linfocitos B y Th, y su migración a través de la barrera hematoencefálica, parecen jugar un papel crucial en el desarrollo de la EM, por lo que la mayor parte de las inmunoterapias con Mabs se han dirigido a su eliminación citotóxica. La Figura 4 resume los Mabs disponibles en la actualidad para el tratamiento de la EM y su mecanismo de acción. En su mayor parte se administran por infusión endovenosa, normalmente con cadencia bianual, precedidos de la administración de fármacos antihistamínicos y antiinflamatorios para disminuir las posibles reacciones adversas de la infusión. A continuación se describen, brevemente, las características de los anticuerpos más relevantes utilizados en la actualidad, su mecanismo de acción y sus reacciones adversas más habituales. Natalizumab Natalizumab fue el primer Mab aprobado por la Agencia Norteamericana de Drogas y Alimentos FDA (Food and Drug Administration) para el tratamiento de EM, en noviembre del 2004. Es un anticuerpo recombinante humanizado contra la integrina α4β1. Por su unión a esta integrina en linfocitos y monocitos, Natalizumab impide su interacción con la proteína VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule) de las células endoteliales, inhibiendo la transmigración de estas células a través de la BHE. En el estudio clínico AFFIRM, Natalizumab redujo la frecuencia de recurrencia anual en un 68% y mostró una reducción de 42% en la probabilidad acumulada de discapacidad sostenida en tres meses. Su principal efecto adverso es la aparición de infección cerebral por el virus de John Cunningham, que puede ser prevenido por la detección en sangre de anticuerpos contra el virus. Ocrelizumab Ocrezilumab, aprobado por la FDA en noviembre 2017, es un anticuerpo recombinante citotóxico humanizado que se une a la proteína CD20 de linfocitos circulantes, provocando su disminución drástica, o incluso su desaparición, impidiendo así su contribución a la cascada desmielinizante. Resulta principalmente útil en la EM primaria progresiva, reduciendo su progresión en un 24%. En el estudio clínico OPERA, Ocrelizumab redujo la recurrencia anual un 47%, mostrando disminuciones del 94% en las lesiones desmielinizantes que captan contraste y descensos de hasta el 77% en la aparición de nuevas lesiones detectables en T2. En la esclerosis primaria progresiva, Ocrezilumab redujo en un 24% la progresión de discapacidad a las doce semanas. Los efectos adversos más comunes incluyen las reacciones adversas a la infusión, por lo que suele recomendarse la premedicación con anti-histamínicos y anti-inflamatorios. Rituximab Rituximab es un Mab quimérico que se une a la proteína CD20 de linfocitos B y induce su muerte celular por apoptosis. Inicialmente recomendado para el tratamiento del linfoma non-hodkin, ha mostrado una eficacia considerable en el tratamiento de la EM. Consigue una depleción del 95% de linfocitos B, sostenida durante 24 semanas. En el estudio clínico HERMES, los pacientes tratados con Rituximab mostraron una reducción del 91% en el número de lesiones que captan contraste a las 24 semanas, descendiendo la frecuencia de “brotes” en un 20%. Entre sus efectos adversos figuran eventuales reacciones a la infusión, fiebre neutropénica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, sinusitis, nasofaringitis, infecciones del tracto respiratorio superior, infecciones del tracto urinario, y arritmias cardiacas. Ofatunumab Ofatunumab es un Mab completamente humanizado que se une a la proteína CD20 de linfocitos B, induciendo su lisis citotóxica. Está aprobado, desde 2009 por la Agencia de Administración de Drogas y Alimentos (Food and Drug Administration, FDA), para el tratamiento de la leucemia linfática crónica, el linfoma no-hodkin folicular, así como en la artritis reumatoide y esclerosis múltiple, por vía subcutánea. Su epítopo diana está localizado en el bucle pequeño de CD20, cercano a la membrana y a la superficie del linfocito, una localización diferente a los epítopos alcanzados por Rituximab y Ocrelizumab. El estudio clínico MIRROR mostro una reducción del 65% en el total de lesiones captadoras de contraste en T1 MRI, tras la administración subcutánea de este anticuerpo. Sus efectos secundarios incluyen; picores, urticaria, dolores de cabeza, nasofaringitis, hipersensibilad y dificultades respiratorias. Ublituximab Ublituximab es un nuevo Mab quimérico, modificado en su región glicosilada, con afinidad incrementada para Fcγ y receptores RIIIa linfociticos, que incrementa su actividad citotóxica anti-CD20. Su tiempo de infusión es tan sólo de 1h-2h, considerablemente más corto que en las otras terapias anti-CD20. Un estudio clínico fase II con once meses de duración, mostró una reducción del 7,67% en el volumen de las lesiones T2 MRI, con desaparición de recurrencias en el 98% de los casos durante los primeros seis meses de tratamiento. Adicionalmente, el 93% de los pacientes no mostraron confirmación de progresión en su discapacidad. Entre sus reacciones adversas se ha relacionado; reacciones moderadas a la infusión, dolores de cabeza, entumecimiento, catarros, naúseas/vomitos y infecciones del tracto respiratorio superior. Alentuzumab Alentuzumab es un anticuerpo humanizado citolítico anti-CD52, que afecta a linfocitos B, monocitos y células auxiliares Th. Se administra intravenosamente en cinco dosis diarias consecutivas de 12 mg/dia, y tres dosis iguales diarias consecutivas administradas un año después. Alentuzumab mostró una reducción del 54 % en la tasa de recurrencia anual, sin cambios significativos en la progresión de discapacidad y una reducción del 63% en las lesiones captadoras de contraste y del 17% en lesiones con aumento de T2. Entre sus efectos secundarios destacan el riesgo incrementado de infarto cerebral y daño arterial, el desarrollo de otras enfermedades autoinmunes como tiroiditis, anemia hemolítica autoinmune o el riesgo incrementado de neoplasias de tiroides, melanoma, enfermedades linfoproliferativas e infecciones. Opocinumab Opocinumab es un Mab completamente humanizado dirigido a LINGO-1. Inhibiendo LINGO-1, las células precursoras de oligodendrocitos (OPcs-Oligodendrocyte Precursor Cells), pueden diferenciarse a oligodendrocitos maduros (OLC-Oligodendrocyte Cells) que remielinizan las placas de desmielinización. Opicinumab demostró, en el ensayo clínico RENEW, un aumento de 9.1 ms. en la velocidad de transmisión del impulso nervioso en pacientes con neuritis óptica, aunque no se pudieron demostrar aumentos en remielinización en 24 semanas. El estudio clínico SYNERGY evaluó la utilidad de coadministración de Opocinumab con Interferon-γ, mostrando un incremento de remielinizacion con Opicinumab en dosis de 10 mg/Kg y 30 mg/Kg. Opocinumab es normalmente bien tolerado, aunque se han destacado reacciones moderadas de hipersensibilidad. Conclusiones y perspectivas futuras Los procedimientos de ingeniería de anticuerpos han contribuido un avance espectacular en todas las inmunoterapias en general, y en los tratamientos de la EM en particular. Han supuesto además un gran progreso tecnológico, superando los procedimientos de inmunización animal y la tecnología de hibridomas. A la velocidad de aprobación actual de cuatro productos/año, aproximadamente 70 nuevos Mabs estarán disponibles en 2020, con unas ventas previstas de 125 billones de dólares. Sin embargo, las terapias de la EM con Mabs no están exentas de limitaciones. La mayor parte de los Mabs tienen una eficacia limitada y pueden presentar reacciones adversas importantes. Aumentos en la especificidad y disminución de efectos secundarios constituyen un abierto campo de mejora en el futuro. Por otro lado, las inmunoterapias actuales involucran un reducido número de dianas, incluyendo CD20, CD52 y LINGO-1. Un aumento en el número de dianas y en el de células inmunes atacadas podrían mejorar en el futuro los resultados terapéuticos actuales. Todo ello requerirá un conocimiento más preciso de los mecanismos moleculares que subyacen al ataque autoinmune desmielinizante. Finalmente, la frontera actual más difícil de superar consiste en la remielinización eficaz de las lesiones. Mejoras en este aspecto podrían conducir no sólo a “reducir” o “detener” el progreso de la enfermedad, sino definitivamente, a su curación. Agradecimientos El autor desea expresar su agradecimiento al proyecto MULTITARGET&amp;VIEW-CM (S2017-BMD3688) financiado por la Comunidad de Madrid y a la Real Academia Nacional de Farmacia, sin cuya colaboración no hubiera resultado posible la elaboración de este artículo. También desea agradecer a D. Javier Pérez CSIC, la elaboración profesional de las figuras.